局所分化によるオルガノイドの生成とイメージングのための勾配から切片化への CUBE ワークフロー

Communications Biology volume 6、記事番号: 299 (2023) この記事を引用

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オルガノイド培養の進歩により、さまざまな方法で天然の組織を模倣するさまざまな in vitro ミニ臓器が誕生しました。しかし、体軸パターンを備えた複雑なオルガノイドを生成し、実験後の分析プロセス中にオルガノイドの向きを維持することにはボトルネックが残っています。ここでは、CUBE 培養デバイスを使用してモルフォゲン勾配でオルガノイドを培養し、続いて CUBE でサンプルを切片化して勾配方向に関する情報を保持するワークフローを紹介します。我々は、CUBEの反対側の2つの別々の分化培地で培養されたhiPSCスフェロイドが、対照におけるマーカーの均一な分布とは対照的に、それぞれの分化マーカーの局所的な発現をもたらすことを示す。また、勾配配向情報を保持するために、CUBE でスフェロイドをクライオおよびパラフィンで切片化するプロセスについても説明します。勾配培養から CUBE による切片化までのこのワークフローは、ますます複雑になるオルガノイドを生成し、その発生プロセスを in vitro で研究するための便利なツールを研究者に提供します。

本物の標本は困難な倫理的問題を提起するため、多能性幹細胞 (PSC) とそれに由来するオルガノイドは、人間の発生初期における組織や器官の形成をモデル化して研究するための実用的な方法を提供します 1,2,3,4。天然組織を模倣するさまざまなオルガノイドを生成するプロトコルは、一般に、異なる時点での Nodal、Hedgehog、Notch、Wnt、または BMP などのシグナル伝達経路の活性化または阻害を連続的に操作して、特定の系統への分化を誘導することに依存しています。腸5、腎臓6、肺7のオルガノイド、胚盤葉上層8,9、ガストルロイド10の生成。

それにもかかわらず、体軸に沿った細胞の成長と分化を制御することは、3D オルガノイド培養において依然として課題です。 in vitro のオルガノイドにおける前方-後方および背側-腹側のパターン形成は、細胞の自己組織化によって生じることもあり、11,12、異なる脳領域をもつ大脳オルガノイドや肝臓、胆管を備えた胆管オルガノイドのように、別々に分化したオルガノイドを集合体として融合させることによっても達成されます。管および膵臓の構成要素13、14。ただし、これらの方法の限界は、細胞が単一の均一培地で培養されるため、細胞に供給される空間情報に関する制御レベルが非常に低いことです。オルガノイドを構成する細胞クラスター内のすべての細胞は、培地中のシグナル伝達分子から同じ分化の合図を受け取ります。一方、生体内では、他の供給源からのモルフォゲンの濃度勾配も、細胞がどこへ行くのか、発生中にどのような表現型やパターンをとるべきなのかを制御するのに貢献します15,16。例えば、神経管の形成は脊索および非神経外胚葉層からの信号に依存しており 17、腎臓のネフロンは尿管芽と後腎間葉の間でのさまざまな信号の交換によって発達します 18。したがって、生体内での天然組織によりよく似たオルガノイドを生成するには、モルフォゲン勾配を複製する必要がある。

インビトロでの細胞へのシグナル伝達分子の空間勾配の供給を模倣するために、いくつかの工学技術が開発されている。ソニックヘッジホッグ (Shh)19 を発現するように操作された PSC 19 またはモルフォゲンを染み込ませたアガロースビーズ 20 を、発生中のオルガノイドの近くに配置すると、ソースから分化細胞への分子の拡散により、モルフォゲンの高濃度から低濃度への濃度勾配が形成されます。さらに、細胞を 2 つの別々の培地コンパートメントで培養できるようにするさまざまな改良トランスウェルやマイクロデバイスも開発され、細胞全体に反対方向のモルフォゲン勾配を生成しています 21、22、23、24、25、26。しかし、これらの技術には欠点がないわけではありません。(1) 複雑な準備と設定手順が必要であり、専門的なスキルや設備がなければ、ほとんどの生物学ベースの研究室では実行するのが容易ではありません。(2) 装置の配置や位置を制御することができません。 (3) 実験後に、サンプルに大きな損傷を与えたりサンプルの向きを失わずに、さらなる分析のためにサンプルをデバイスから取り出すことは困難です。特に、細胞が受けた勾配の方向に関する情報を保持できることは、サンプルの適切な分析を確実にするために重要です。

したがって、我々は、画像解析プロセスのためのサンプルの完全性と勾配配向を維持しながら、明確な局所パターンを持つPSCのオルガノイドへの分化を制御するための、シンプルで使いやすい勾配培養プラットフォームを開発することによって、これらの問題に対処することを目指しました。これを達成するために、ECM ハイドロゲルで培養されたサンプルの取り扱い能力と、細胞播種とパターン形成の再現性を向上させるために以前に開発された CUBE 培養デバイスを利用します 27,28。 CUBE デバイスは、内部のサンプルを視認できる透明な壁を備えたシンプルな硬質材料フレームで構成されているため、実験の要件に合わせて CUBE の設計と構成を簡単に調整できます。たとえば、この研究では、流体デバイスとの一体化を確実に防水するためにフレーム設計が変更され、フレーム材料は実験後のサンプル処理で使用される有機試薬と適合するように選択されました。ここでは、まず iPSC 細胞スフェロイドを CUBE 内の目的の位置に正確に配置する方法を示します。次に、複雑なポンプシステムをセットアップする必要がなく、CUBE 内で 2 コンパートメントのグラジエントチップデバイスに移すだけで iPSC の局所分化を誘導するグラジエントを容易に生成できることを実証します。最後に、グラジエント配向情報を維持しながらイメージングおよび分析を行うための、さまざまな実験後処理方法（クライオおよびパラフィン切片）とグラジエントプラットフォームの互換性を示します（図1）。この Gradient-in-CUBE ワークフローを使用すると、体軸分化を制御したオルガノイドを実現でき、これまで以上に複雑な in vitro モデルを提供して、細胞の分化と組織、器官への発生の方向付けにおけるモルフォゲン勾配の効果を体系的に適用して研究できます。そして最終的には、人間の発達プロセスの理解をさらに進めるための身体システム。

この研究のコンセプトは、CUBE 培養装置を利用して、まず細胞の播種位置を目的の位置に制御し、次に CUBE を Gradient-in-CUBE チップに転送してモルフォゲン勾配で細胞を培養し、最後に c CUBE を使用してサンプルをセクション化し、セクション内の勾配配向情報を維持します。

モルフォゲンシグナル伝達の勾配は、発生中の組織における細胞運命の特定とパターン形成に寄与しており 29、この現象を in vitro で再現することで、ますます複雑なオルガノイドモデルの開発を促進できる可能性があります。しかし、ウェルプレート内の単一の均一培地で培養され、パターニングのために主に自己組織化に依存するオルガノイドでは、勾配キューによる区別を達成するのは困難です。モルフォゲン勾配を使用してオルガノイドを培養する方法については多くの報告がなされています 19,20,31 が、複雑なセットアップと貧弱なサンプル処理能力、分析中の勾配配向の維持により、オルガノイドコミュニティによるその広範な採用が制限されています。 CUBE装置の扱いやすさを活かし、モルフォゲングラジエントによるオルガノイド培養からグラジエント配向によるサンプルイメージングまでのワークフローを以下のプロセスで確立しました。 (1) CUBE内の細胞の初期播種位置を制御し、 (2) 細胞サンプルの軸に沿ってモルフォゲンシグナル伝達の勾配を生成し、(3) CUBE でサンプルを切断して勾配方向の情報を保持します。

CUBE 内でのセルの正確な配置は、セルが受け取る勾配シグナル伝達の一貫性を確保するために重要です。たとえば、CUBE の一端に近づきすぎたセルによって検知される勾配情報は、CUBE の中央にあるセルによって検知される勾配情報とは異なります。 CUBE 内の細胞の播種位置を制御するために、CUBE 内のハイドロゲルの目的の位置に播種ポケットを作成するための柱構造を備えたモールドキャップと、CUBE へのモールドキャップの正確な嵌合を保証するための溝が必要です。が設計されました (図 2b(i))。播種ポケットとポケット内に播種細胞スフェロイドを作成するプロセスは図 2b(ii) に示されており、方法のセクションで説明されています。この播種方法を利用すると、ばらつきが大きく不正確な播種が発生するガイドなしで手動で細胞を配置する場合と比較して、ばらつきが少なく常に希望の位置に細胞を播種できます(補足図1)。高度な訓練を受けた人やロボットであれば、モールドキャップを必要とせずに未硬化ゲル内に細胞を高精度に配置できる可能性があると主張することもできますが、コラーゲンやマトリゲルなどのソフトヒドロゲルのゲル化挙動は、状況に応じて大きく異なる可能性があります。温度やサンプルの取り扱いに影響するため、ゲルがいつ十分に重合して細胞を所定の位置に保持できるようになるかを予測するのは困難です。この方法が誰でも簡単に利用できることを強調するために、CUBE やモールドキャップの使用経験のない研究室秘書と中学生を採用して、同じ実験を行ってもらいました。最小限のトレーニングで、両方とも経験豊富なユーザーと同様のレベルの精度で、またモールドキャップなしの経験豊富なユーザーと比較して大幅に高い精度でシーディングに成功しました（補足図1）。

CUBE 製造プロセス (i) CUBE はパラフィンおよびクライオセクショニング用に設計されています。 (ii) PDMS 側壁を CUBE デバイスに接着するプロセス。 b 細胞播種プロセス (i) モールドキャップの設計。 (ii) CUBE 内のハイドロゲル内のモールドキャップによって作成された播種ポケットに細胞を播種するプロセス。 c Gradient-in-CUBE 製造プロセス (i) チップの蓋とベースを製造するための金型の設計。 (ii) PDMS チップを金型から製造し、両面 PDMS 接着シールである NSD によって蓋をベースに接着するプロセス。 d 画像化のための切片化。 (i) サンプルを凍結培地に包埋し、CUBE で切片化するプロセス。 (ii) CUBE ホルダーを使用してサンプルをパラフィンに包埋し、サンプルの方向を維持するためにマークされた端で切片を作成するプロセス。

CUBE の長さ全体に勾配を確立するために、ベースコンポーネントと蓋コンポーネントで構成される Gradient-in-CUBE チップが設計され、成形プロセスによって製造されました。ベースの型には、CUBE 用のコンパートメントと 2 つの別々の媒体チャンバー、および O リングを取り付けるための溝が含まれていました。蓋の型には、2 つの別々の培地チャンバーに培地を追加するための 2 つのポートがあります (図 2c(i))。チップの製造プロセスは図 2c(ii)、(iii) に示されており、CUBE がどのようにチップと統合されるかを示す補足ムービー 1 とともに方法セクションで説明されています。

FITC-デキストランとTRITC-デキストランを使用して、CUBEへの2つの異なるタイプの培地の添加をシミュレートし、毎日のイメージングを実行して、5日間にわたるCUBE内の二重勾配形成の進行を監視しました（図3a））。 CUBE のウィンドウの中央領域 (x – x') にわたる FITC および TRITC の平均濃度 (C) が測定され、以下に示すように、ソース側の高濃度からシンク側の低濃度への逆の勾配が示されました。それぞれのデキストラン分子は、高濃度に濃縮されている側から、濃度がはるかに低い反対側に移動します (図 3b)。 10 μM のデキストランがソースリザーバーに添加され、FOV のソース端での平均最大濃度は FITC = 2.618 μM および TRITC = 3.255 μM でしたが、シンク端での最小濃度は FITC = 0.024 μM および TRITC でした。 = 0.026μM。勾配は、FITC の場合は Ix0.2/Ix2.0、TRITC の場合は Ix2.0/Ix0.2 の比として計算されました。値 1 は勾配がないことを示し、比が大きいほど勾配が急であることを示します (図 3c)。分子がゲルに入り始めると、勾配の急勾配は増加し、最初の 24 時間でピークに達しますが、分子が CUBE 内のゲル内と同様に反対側にも蓄積するため、勾配の急勾配は 2 日目までに減少します。それにもかかわらず、DPBS で毎日洗浄し、新鮮なデキストランと交換すると、培地が平衡状態に達することなく、一定の勾配を 5 日間維持できます。この研究では、アガロースゲルへの 40 kDa デキストランの拡散のみを使用して、ECM ハイドロゲルへの成長因子の拡散をモデル化しました。これらは、発生において重要なシグナル伝達の役割を果たす Wnt の分子量が約 40 kDa であること、およびデキストランとアガロースが数多くの物質輸送と拡散の研究で使用されている容易に入手可能な試薬であることに基づいて選択されました。分子量の異なる既知のモルフォゲン勾配が多数存在し、細胞培養に使用できるヒドロゲルの選択肢が膨大であるため、本研究ではモルフォゲンとヒドロゲルの組み合わせのさまざまな組み合わせを調査することは妥当ではありませんでした。

a 5 日間にわたって形成される FITC-および TRITC-デキストラングラジエントのイメージング。使用済みデキストランを除去し、培地チャンバーを DPBS で洗浄し、新鮮なデキストランをチャンバーに添加した後、24 時間ごとにイメージングを実行しました。 CUBE の窓の寸法は w = 2.75 mm でした。 h = 3.5 mm、4 倍の倍率での撮像視野は w = 3.6 mm でした。高さ = 2.7 mm。スケールバー = 1 mm。 b 濃度 C は、x から x' までの蛍光画像の中央領域 (w = 2.2 mm; h = 2.2 mm) の各ピクセルの y 軸に沿った平均強度を標準から得られた強度と線形相関させることによって決定されました。 FITC-およびTRITC-デキストラン濃度の曲線フィッティング。スケールバー = 1 mm。マーカーは 50 ピクセル (約 0.3 mm) ごとに選択されたデータポイントを表し、線は線形最小二乗の最適フィットを示します。 n = 5。FITC の個々の線の傾きは、0 日目は -0.0044、1 日目は -0.5586、2 日目は -0.5607、3 日目は -0.5549、4 日目は -0.5487、5 日目は -0.5391 でした。 TRITC では、傾きは 0 日目は 0.0095、1 日目は 0.7644、2 日目は 0.7062、3 日目は 0.6504、4 日目は 0.5897、5 日目は 0.6039 でした。0 日目にはほとんど勾配が見られませんが、1 日目までに濃度勾配が大きくなります。 FITC と TRITC のそれぞれについて、CUBE の一端から反対側の端まで逆方向に生成されます。 c ソースエンドの濃度とシンクエンドの濃度の比は、勾配の急峻さを表すものとして採用されました。分析された領域は、回転楕円体が位置するおおよその領域として x = 0.2 mm から x = 2.0 mm でした。勾配は 1 日目が最も急で、2 日目以降は勾配が緩やかになったものの、5 日間は一定の勾配を維持できます。 d 片側に中胚葉誘導培地（M）、反対側に神経外胚葉誘導培地（NE）を使用したhiPSCスフェロイドの分化により、スフェロイドの両端で異なる形態のスフェロイドが得られますが、Mでは形態が比較的均一ですまたは NE のみのコントロール。スケールバー = 500 μm。

単一または数個の細胞の長さのスケールにわたる勾配が細胞に位置情報を提供するには十分であることを考えると、Gradient-in-CUBE チップで生成された勾配は反対側の局所的な分化を誘導するのに十分であるはずであると仮定しました。回転楕円体の端。さらに、モルフォゲンとその阻害剤の間の相互作用も生体内組織のパターン形成にとって重要であるため、モルフォゲンの蓄積に対抗する別の戦略は、勾配の反対側にモルフォゲンの阻害剤を補充することです。たとえば、胚の前部にある Wnt および Nodal のアンタゴニストである Dkk1、Lefty-1、および Cer-1 は、Wnt/Nodal を胚の後端に制限して、前後軸を確立します 34。

単一のスフェロイドを 2 つの局在領域に分化するための Gradient-in-CUBE チップの適用を実証するために、CUBE の一方の端に神経外胚葉分化培地 (NE) を供給し、反対側に中胚葉分化培地 (M) を供給しました。中胚葉培地 (Lam らのプロトコルに基づく 35) には高濃度の Wnt 活性化因子 CHIR99021 が含まれていたのに対し、神経外胚葉培地 (Bianchi らのプロトコルに基づく 36) には Nodal/Activin 阻害剤 SB431542 とともに低濃度の Wnt 活性化因子が含まれていました。神経外胚葉側の中胚葉分化に対抗するため。分化の 4 日後、回転楕円体の両端で形態学的差異が観察され、神経外胚葉側のより滑らかな特徴と比較して、中胚葉側はよりでこぼこでより突出する特徴を有していた。対照的に、コントロールのスフェロイドはかなり均一な形態学的特徴を示しました。中胚葉コントロールは表面全体にでこぼこした突起がありました。神経外胚葉コントロールの表面はより滑らかでした（図３ｄ）。

オルガノイドのような大規模な 3D サンプルでは、レーザーの透過範囲が限られていることに加え、低倍率の対物レンズの感度が低く、高感度の対物レンズの焦点距離が短いため、細胞の多能性や分化マーカーの発現を視覚化することは多くの場合困難です。レンズ。したがって、オルガノイドは、染色やイメージングのために低温培地またはパラフィンに埋め込まれ、薄い切片にスライスされることがよくあります。しかし、一般的なグラジエント発生装置からサンプルを取り出した後、サンプルの方向が失われることがよくあります。 CUBE デバイスの利点は、細胞が CUBE 内に含まれており、サンプルに損傷を与えることなく回収できることだけでなく、グラジエントの方向を後で認識できるように簡単にマークできることです。ここでは、CUBE 内のサンプルをクライオおよびパラフィン切片用に処理できることを示します。

クライオセクショニングの場合、O リングが取り付けられていた CUBE の一端の厚いフレームが方向マーカーとして機能します。 Gradient-in-CUBE チップからサンプルを取得した後、凍結する前に CUBE をスクロースおよびクライオ包埋媒体に浸すだけです。凍結したら、CUBE フレームと PDMS 外壁を基準としてサンプルの方向を保持しながら、CUBE をサンプルと一緒にスライスします (図 2d(i) および 4a)。 NE-M 勾配で分化した hiPSC スフェロイドの免疫蛍光染色から、神経外胚葉マーカー Sox2 と中胚葉マーカー Brachyury の局在がスフェロイドの両端にそれぞれ観察されましたが、対照サンプルでは、両方のマーカーがスフェロイド全体で均一に発現していました (図 1)。 4b）。そこで、サンプルをそのまま CUBE 上で切片化し、モルフォゲン勾配で微分したスフェロイドの方向情報を保存する方法を実証しました。ただし、この方法の欠点は、硬質アクリル材料を繰り返し切断することによってミクロトームのブレードが損傷し、頻繁に交換する必要がある場合があることです。この問題は、CUBE フレームにポリカーボネートやテフロンなど、切断しやすい柔らかい素材を使用することで解決できる可能性があります。あるいは、骨などの硬いサンプルを切断するために一般的に使用される鋸ミクロトームまたはダイヤモンドコーティングされたブレードを使用して、CUBE フレームを切断することもできます。

低温切片化とイメージング。 (i) サンプルの向きの参照マーカーとして CUBE フレームを使用して、CUBE で凍結サンプルを埋め込み、切片化する手順。 (ii) M-NE 勾配で分化した hiPSC スフェロイドの免疫染色では、中胚葉 (Brachyury) および神経外胚葉 (Sox2) マーカーの局所的な発現パターンが示されましたが、NE のみおよび M のみのコントロールではマーカーの均一な分布が示されました。 b パラフィン切片作成とイメージング。 (i) サンプルの損失を防ぐために CUBE ホルダーを使用してパラフィンサンプルを包埋し切片化し、次にサンプルを CUBE から取り出し、サンプルの端を切断して方向をマークする手順。（ii）内胚葉（END）-NE勾配で分化したhiPSCスフェロイドの免疫染色は、内胚葉（FoxA2）および神経外胚葉（Nestin）マーカーの局所的な発現パターンを示しましたが、NEのみおよびENDのみのコントロールはマーカーの均一な分布を示しました。

パラフィン切片の場合、CUBE 内のサンプルの完全性と勾配配向を保存するために、いくつかの追加の手順を実行する必要があります (図 2d(ii) および 4b(i) および補足図 2)。アクリルフレームと柔らかい材質のPDMS壁を組み合わせたクライオCUBEではCUBEでの切片加工が可能ですが、パラフィンCUBEはCUBE全体がアクリルでできているため、切片加工が非常に困難です。 PDMS はパラフィン包埋プロセスで使用される有機溶媒と互換性がないため、これは必要な変更でした。パラフィン包埋前の最初の脱水プロセス中に、ヒドロゲルは大幅に体積を失い、CUBE 内で収縮します。 CUBE から外れてサンプルを紛失するリスクを回避するために、蓋とベースで構成される CUBE ホルダーは、CUBE の上部と底部の開いた表面の大部分を覆いながらも、試薬が内部と外部を通過できるように設計されました。標本、見本。次に、ホルダー内の CUBE をワイヤーで結び、それらをまとめます。パラフィン処理後、プッシャージグを使用してサンプルを CUBE から取り出し、サンプルの 1 つの角のエッジを切断して方向をマークしました。パラフィン法の適用を実証するために、CUBE の両側の NE および内胚葉 (END) 分化 (Lam et al.35 によるプロトコルに基づく) 培地で hiPSC スフェロイドを分化させました。神経外胚葉マーカー Nestin と Sox2、および内胚葉マーカー FoxA2 と Sox17 の免疫蛍光染色は、それぞれスフェロイドの NE 側と END 側に局在を示しました（図 4b（ii）および補足図 3）。一方、勾配培養を行わない対照サンプルは、スフェロイド全体にわたってマーカーの均一な発現を示しました。

ここでの FITC/TRITC-デキストランと NE/M、および END/NE の分化実験は、CUBE 内でモルフォゲン勾配を生成でき、細胞スフェロイドの分化を制御するために使用できることを実証しました。ただし、この論文で示したプラットフォームによって生成される勾配は、ソースから CUBE 内のゲルを横切ってシンクまでの分子の自由拡散のみに依存していることに注意してください。自由拡散の速度は、溶質のサイズ、電荷、および溶解度37、ならびにヒドロゲルマトリックスの細孔サイズ、電荷、およびポリマーの移動度38に依存するため、特定のモルフォゲン生成を考慮した詳細な実験またはシミュレーション研究が必要です。勾配生成のさらに細かい制御を達成するには、物質輸送の詳細を理解するために、分子、各分子の拡散率、およびヒドロゲルの特性が各分子の拡散にどのような影響を与えるか39,40,41,42,43,44,45が必要になる可能性がありますが、このレベルの精度はこの研究の範囲を超えています。あるいは、培地中の増殖因子の濃度を一定に保つことは、グラジエントの精度をより良く制御する 1 つの方法です。たとえば、培地をより頻繁に変更または混合したり、サンプルに新鮮な培地を一定流量ポンプで送り込んだりします。これらの方法では、セットアップと培養手順がさらに複雑になります。

細胞運命の誘導におけるモルフォゲン勾配の役割とメカニズムは複雑であり、まだ完全には理解されていません。細胞が自己組織化して組織の特定のパターンを形成するとき、細胞自体とそのすぐ周囲の細胞の分泌物によって生成される局所的な勾配と、細胞を取り囲む ECM の外部勾配の両方が、遠く離れた細胞によって生成されます。周囲の間葉にあるものは、細胞分化の制御に寄与します15、16。反応拡散モデル、位置情報 (フランス国旗)、合成拡散クリアランスモデルなどの理論モデルは、細胞とモルフォゲン間の短距離および長距離相互作用と、その結果として生じるパターン形成を説明または予測するために使用されてきました 29,45。しかし、これらの研究は細胞の局所環境に焦点を当てています。一方、CUBE 勾配プラットフォームは、乳腺や腎臓の分岐パターンなど、臓器の高次構造の形成に役割を果たす末梢の他の細胞集団による外部勾配の供給を模倣することを目的としています。、または肺47、48、49。したがって、所望のパターンを持つ特定の標的オルガノイドを開発するには、細胞とさまざまなモルフォゲンの勾配の間の相互作用、および勾配形成のタイミングの詳細な最適化が必要となります。さらに、対照サンプルの両端に添加された成長因子がまったく同じであったとしても、成長因子が反対側の端からゲルに入るときに成長因子の勾配も存在し、これが自己にどのような影響を与えるかについての長期研究が必要です。 -将来的には、より大きな回転楕円体やより小さな回転楕円体内の細胞の組織化が必要になるでしょう。

CUBE とグラジエントチップの設計はユーザーのニーズに応じてカスタマイズできるため、このプラットフォームは、CUBE の 4 つの側面にグラジエントを適用して前後軸および背腹軸を持つオルガノイドを生成するなど、非常に複雑なオルガノイドの開発にも適用できます。。

PDMS を使用して勾配チップを製造することの主な欠点の 1 つは、PDMS の疎水性によりタンパク質や小分子が PDMS 表面に吸収されることです 50、51、52。それにもかかわらず、PDMS には、生体適合性、ガス透過性、光学的透明性、製造プロセスの容易さなど、多くの利点があります。タンパク質の吸収を減らすことが報告されている比較的簡単な方法もいくつかあり、これには、PDMS53 の親水性を高めるために PDMS とポリ（エチレングリコール）（PEG）を混合することや、表面をテフロン、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）ポリマーまたはパラフィンでコーティングすることが含まれます。ワックス54、55、56。

分化マーカーの免疫蛍光染色はスフェロイドの局所的な分化を示しますが、図 4b(ii) の内胚葉コントロールの場合のように、各サンプルの構造と形態は異なります。この変動の理由としては、細胞スフェロイドの位置は制御されているものの、初期スフェロイドが 96 ウェルプレートで形成され、スフェロイドの形状が制御されていないことが考えられます。いくつかの研究が、インビトロ培養における発生のパターン化および対称性の破壊事象の模倣における幾何学的制約の寄与を報告しているため、将来的には、スフェロイド形成前に 3D ハイドロゲル内に単一細胞を配置するためにモールドキャップ法を適用する方が良いかもしれません。炭水化物ガラスで所望の幾何学的形状を 3D プリントし、ゲルが硬化した後に炭水化物を溶解して、対応する所望の形状を備えたシーディングポケットを残すなど、最初のシーディング形状を制御します59。

CUBE とチップ設計のモジュール性の利点は、実験のニーズに応じて材料を選択できることです。たとえば、光透過性が優先される場合は、PDMS ウィンドウを備えた CUBE の方が適しています。一方、実験後の分析のためにサンプルのパラフィン化が必要な場合は、PDMS と有機溶媒の不適合性により光学的透明性がわずかに低下するとしても、PDMS を含まない完全にアクリル製の CUBE がより適しています。したがって、グラジエントチップの材料の選択は、CUBE の材料と同じである必要はなく、材料の長所と短所を考慮して選択する必要があります60,61。

モルフォゲン勾配を使用した 3D オルガノイドの培養は、複雑な勾配デバイスのセットアップと分析プロセス中の勾配の方向の維持の両方の点で長い間課題でした。この論文では、モジュール式 CUBE 培養デバイスを利用して Gradient-in-CUBE デバイスを簡単にセットアップする、グラジエント培養からイメージングまでのワークフローを紹介します。流れと圧力を使用して動的に制御できる標準的なマイクロ流体チップで生成される勾配と比較して、当社の単純な勾配デバイスを使用して生成される勾配は、分子の自由拡散のみに依存するため、時間の経過とともに制御することが困難になります。ただし、ここで紹介するプラットフォームは生物学者にとっての使いやすさに焦点を当てており、ポンプやシリンジを含む複雑なセットアップは必要ありません。さらに、CUBE の以前のバージョンが市販されたのと同じように、ユーザーの要件に合わせてさまざまな変更を加えた CUBE が市販されると、エンジニアリングにあまり関心のない研究室による CUBE プラットフォームの使いやすさと採用がさらに増加するでしょう。さらに、実験後は、勾配が形成された方向に関する情報を保持しながら、サンプルを損傷することなくデバイスから簡単に取り外すことができます。選択した支持 ECM 材料の特定の成長因子に最適な勾配を決定するには、培養プロトコルのターゲットオルガノイドに依存した追加の最適化が必要になる場合がありますが、この論文の簡単でカスタマイズ可能な方法論は、対称性の破れを通じてオルガノイドの開発を大幅に前進させる可能性があります。。

ただし、将来の研究で考慮すべき興味深い点は、モールドキャップによって作成される播種ポケットのサイズに関連して、スフェロイドのサイズに応じて細胞が経験する機械的刺激の違いが寄与する可能性があることです。追加のヒドロゲルを含むポケットでは、スフェロイドをポケットに播種するときにポケット内の過剰な培地により、ゲルの剛性に多少の変動が生じる可能性があります。現在の形式の Gradient-in-Cube プラットフォームは一方向の勾配のみを生成しますが、2 つの軸、たとえば同じオルガノイドの前後軸、背腹軸の勾配を生成するように適応できる可能性もあります。、現在取り組んでいる作業です。したがって、局所分化によるオルガノイドの生成から勾配情報による解析までのワークフローは、ますます複雑になるオルガノイドを開発するための使いやすい方法を研究者に提供し、発生プロセスに関与する対称性の破れなどのさまざまなメカニズムの理解を広げる可能性があります。

ヒト iPSC (IMR90-4; WiCell Research Institute; WB65317) は、9 ～ 10 μg/cm2 成長因子低減マトリゲル (Corning、356231) でコーティングされたディッシュ上で mTeSR Plus (STEMCELL Technologies、100-0276) で維持され、ReLeSR を使用して定期的に継代されました。 (STEMCELL Technologies、05872) を使用し、37 °C、5% CO2 インキュベーターで培養しました。 MycoAlert キット (Lonza、LT07-118) を使用して、細胞のマイコプラズマ汚染をテストしました。スフェロイド形成用の96ウェルプレートを準備するために、ウェルに80μL/ウェルの3%アガロース(Sigma、A9414)を充填し、固化させた。次いで、StemFit AK02N (Ajinomoto、RC AK02N) 培地と 10 μM Rock 阻害剤 (Y-27632; Nacalai Tesque、08945-84) をウェルに添加し、インキュベートしました。スフェロイド形成のために、ReLeSR を使用して 70% コンフルエントな細胞を解離し、遠心分離後、アガロースウェルプレートに播種する前に StemFit +Y27632 培地に再懸濁しました。 1 つの 35 mm ディッシュからの細胞を使用して 5 つのスフェロイドを作成しました (スフェロイドあたり約 2 ～ 3 × 104 細胞)。翌日、培地をY27632を含まないmTeSR Plus培地に切り替えた。 mTeSR Plus で 1 日間培養した後、スフェロイドを CUBE デバイスに移しました。

特にパラフィン化プロセスでは有機試薬の使用が必要となるため、CUBE の材料の選択は、各手順の要件に適合するように慎重に検討する必要がありました。 CUBEのフレームは、従来のポリカーボネートから、ポリカーボネートに比べてキシレン処理の短時間耐性に優れたアクリル素材に変更されました。さらに、透明なシリコーンベースの生体適合性材料であるポリジメチルシロキサン (PDMS) を側壁材料として使用して、CUBE を通るモルフォゲン含有媒体の移動を CUBE の上面と底面のみに制限し、それによって 1 つの軸のみに勾配を生成しました。キューブの。

この研究では、Rhinoceros 3D ソフトウェア (Robert McNeel & Associates) を使用して、2 種類のアクリル (ポリ (メタクリル酸メチル)、PMMA) CUBE を設計しました。クライオセクショニングの場合、CUBE は、ニトリル O リング (AS ONE、62-3049-63) をキューブに取り付けられるように、キューブの上面に厚いフレームを備えて設計されています (図 2a(i))。勾配培養中のキューブ周囲の培地の漏れを減らすための防水シール。 Cryo CUBE の側壁を作成するために、PDMS (Silpot 184、Dow Toray、04133124) を最初に、エラストマーベースと硬化試薬を 10:1 の比率で混合することによって調製しました。次に、混合物の薄層をペトリ皿に広げ、脱気して気泡を除去した。立方体フレームを PDMS 上に置き、再度脱気し、85°C で 30 分間ベークして PDMS を硬化させました。硬化したら、PDMS をメスでフレームから切り取り、このプロセスを繰り返して立方体の他の 3 面を覆い、上面と底面は開いたままにしました（図 2a(ii)）。 PDMS 壁の厚さは CUBE フレームの厚さに相当し、100 mm ディッシュあたり約 2.8 g の PDMS が使用された場合は 0.75 mm になります。 PDMS はキシレンにさらされると膨潤するため、パラフィン切片用の CUBE は側壁なしで設計されました (図 2a(i))。これによりサンプルの透明度はわずかに低下しますが、完全にアクリル製のフレームでも明視野下で十分な視認性が得られました。パラフィン切片の場合、CUBE は 3.5 × 3.5 mm の中空コアを備えた長さ 5 mm の固体立方体として設計され、フレームの厚さは 0.75 mm でした（図 2a(i)）。 PDMS はパラフィン化プロセス中にキシレン中で膨潤するため、パラフィン切片用の CUBE には PDMS 側壁がありませんでした。すべての CUBE は機械加工会社に発注されました (Cryo CUBE は日本の Yumoto Electric Inc から、Paraffin CUBE は日本の Proto Labs から)。使用前に、CUBE を超音波処理で 2 回、MilliQ 水で 1 回、イソプロパノール (IPA) で 1 回洗浄し、オーブンで 2 時間乾燥させました。

CUBE への最初の播種中に細胞の位置を制御するために、モールドキャップは、希望する播種位置に柱構造を備え、柱の位置を揃えることができるようにモールドがキューブの上に確実にフィットするように溝を備えて設計されました。立方体内に適切に配置されます (図 2b(i))。モールドキャップは 3D プリンタ (Agilista 3200、Keyence) を使用して印刷され、余分な印刷サポート材料を除去した後、IPA で 2 回超音波洗浄され、その後 65°C のオーブンで乾燥されました。使用前に、イソプロパノールで 5% に希釈した 2-メタクリロイルオキシメチルホスホリルコリン (MPC; Lipidure、日油株式会社、CM5206E) にモールドキャップを浸漬し、室温 (RT) で 1 時間乾燥させました。 MPC コーティングは、ハイドロゲルからモールドをよりスムーズに取り外すのに役立ちます。 Cryo CUBE のアクリルフレームの厚い部分、つまり Paraffin CUBE の一端付近の約 1 mm にニトリル O リングを取り付けました。 CUBE を O リング側を下にして皿に置き、マトリゲルを CUBE に加えた後、型キャップを CUBE の上に置き、インキュベーター内でゲルを 25 分間硬化させました。ゲルが硬化したら、金型キャップを取り外し、金型によって作成されたポケットに hiPSC スフェロイドを播種しました。次に、追加のマトリゲルを CUBE の上部に追加し、さらに 25 分間硬化させてポケットを密閉しました (図 2b(ii))。硬化後、CUBE を mTeSR Plus 培地を含む 48 ウェルプレートに移し、勾配培養を開始する前に 2 時間インキュベートしました。

PDMS 勾配チップの蓋を作製するための金型は、O リングと媒体を追加するためのポートに適合する溝を備えて設計され、ベースは立方体、O リング、および 2 つの別々の媒体チャンバーに適合するように設計されました (図 2c(i))。）。 PDMS モールドは Proto Labs に注文しました。 PDMS チップを作成するには、未硬化の PDMS を型に注ぎ、脱気して 85 °C で 1 時間ベーキングして PDMS を硬化させました。硬化したら、チップを金型から取り外し、CUBE と同じ方法で洗浄および滅菌しました。グラジエントチップを組み立てるために、O リングを O リングの溝にはめ込み、媒体チャンバーにアクセスするための穴を備えた PDMS 両面接着フィルム (NSD-100、NIPPA) を切り取った状態で CUBE をチップベースに配置しました。蓋と底部を一緒にシールするために使用されました (図 2c(ii))。組み立て後、CUBE の両側の培地チャンバーをそれぞれの分化培地で満たしました (図 2c(iii))。

神経外胚葉分化培地は、10% KnockOut 血清代替物 (Gibco、10828010)、1% MEM 非必須アミノを補充した KnockOut DMEM/F12 (Gibco、12660-012) と Neurobasal 培地 (Gibco、21103-049) の 1:1 混合物で構成されました。酸 (ナカライテスク、06344-56)、1% GlutaMAX (Gibco、35050-061)、1 μM LDN1913189 (シグマ、SML0559)、2 μM SB431542 (ナカライテスク、18176-54)、3 μM CHIR99021 (ナカライテスク) 、18764 -44)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール (ナカライテスク、21438-82)、および 0.5 μM アスコルビン酸 (ナカライテスク、03420-52)。中内胚葉基礎培地は、RPMI培地1640（Gibco、11875-093）、1％GlutaMAX、および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco、15140122）を含んでいた。中胚葉分化のために、5 μM CHIR99021 を 0 日目と 1 日目に中内胚葉基礎培地に添加しました。2 日目から 4 日目まで CHIR99021 を取り除き、100 ng/mL bFGF (ナカライテスク、19155-36) および 1 μM オールトランスで置き換えました。レチノイン酸（Stemgent、04-0021）。内胚葉分化のために、5μM CHIR99021を0日目に中内胚葉基礎培地に添加し、2日目から5日目にCHIR99021を取り除き、100ng/mLアクチビンA(R&D Systems、338-AC-050/CF)に置き換えた。培地交換は、使用済み培地を廃棄し、DPBSで1回洗浄し、新しい培地と交換することにより毎日行った。オリンパス CKX41 顕微鏡を使用して、チップデバイス内の CUBE 内の回転楕円体の位相コントラスト画像を撮影し、回転楕円体の形態学的変化を監視しました。

分析に適切な時点で、サンプルをグラジエントチップから取り出し、固定のために 48 ウェルプレートに移しました。サンプルをDPBSで各回5分間2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで20分間固定し、次いでDPBSで各回10分間2回洗浄した。凍結切片の場合、サンプルを 10%、15%、および 20% スクロース (Wako、194-00011) に各 1 時間連続して浸し、凍結切片包埋媒体 (Tissue-Tek OCT コンパウンド、Sakura Finetek、4583) に浸漬しました。 10 分前に包埋媒体に包埋し、-80 °C で 30 分間凍結します。凍結後、サンプルを型から取り出し、凍結ユニット（ヤマト工器工業製、レトラトーム REM-710）を備えたミクロトーム（ヤマト工器工業製、レトラトーム REM-710）を使用して、CUBE を使用してそのまま厚さ 30 μm に切出しました（図 2d(i)）。、エレクトロフリーズ MC-802A）。スライドガラス上に収集した切片を冷風で 30 分間乾燥させ、次に 40 °C のオーブンでさらに 30 分間乾燥させ、その後 MilliQ 水で洗浄して過剰な包埋媒体を除去しました。過剰な水を除去し、切片を室温で10分間乾燥させた。

パラフィン切片の場合、次の手順でサンプルを脱水し、パラフィンに包埋しました。70% エタノールで 2 時間、70% エタノールで一晩、80% エタノールで 1 時間、95% エタノールで 1 時間、99% エタノールで 1 時間、100 % イソプロパノールで 1 時間 2 回、100% キシレンで 1 時間 3 回、キシレンとパラフィンの 1:1 混合物 (ナカライテスク、26029-05) で 40 °C で一晩、パラフィンで 65 °C で 1.5 時間 3 回。脱水プロセス中のマトリゲルの収縮によるサンプルの損失を防ぐために、ワイヤーで保持された蓋とベースを備えた CUBE ホルダーが CUBE 内にサンプルを含むように設計されました (図 2d(ii))。最後のパラフィンステップの後、サンプルを CUBE ホルダーから取り出し、新しいパラフィンに包埋しました。 CUBE をパラフィンから切り出し、メスを使用して CUBE の内枠に沿ってパラフィンを切断し、CUBE をプッシャージグに押し付けることにより、サンプルを CUBE から取り出しました（図 2d(ii)）。パラフィン化サンプルの一方の端を切断して勾配方向の向きをマークし、ミクロトームを使用してサンプルを厚さ 10 μm のスライスに切片化しました。脱パラフィンは次のように実行されました: 100% キシレン 10 分間 2 回、99% エタノール 5 分間 2 回、95% エタノール 5 分間、80% エタノール 5 分間、70% エタノール 5 分間、MilliQ 水 5 分間。熱誘発抗原賦活化は、サンプルを 10 mM クエン酸緩衝液 (1.8 mM クエン酸、8.2 mM クエン酸三ナトリウム、pH 6) に入れ、沸騰するまで緩衝液を加熱し、その後 1 分間冷却することによって実行されました。沸騰と冷却のプロセスを 10 秒間沸騰させ、その後 1 分間冷却するという手順を 6 回繰り返しました。最後のサイクルの後、サンプルを 30 分間冷却し、次に MilliQ 水で 5 分間、続いて DPBS で 5 分間を 3 回洗浄しました。

凍結切片サンプルを 0.5% Triton X-100 で 10 分間透過処理し、その後 100 mM グリシンで各回 10 分間 3 回洗浄しました。免疫蛍光バッファー (IF バッファー) は、DPBS 中の 0.5% Tween20、2% Triton X-100、および 10% ウシ血清アルブミン (BSA; Sigma、126615) で構成されました。ブロッキングは、サンプルを 10% ヤギ血清 (Gibco、16210064) を含む IF 緩衝液 (IF + G) で 30 分間インキュベートし、その後 1% ヤギ抗マウス IgG (Bether Laboratories、A90-116A) を含む IF + G で 20 分間インキュベートすることによって実行しました。分。補足表 1 に従って抗体を希釈しました (1:200 または 1 μg/mL)。一次抗体を 90 分間インキュベートし、二次抗体 (Alexa fluor、1:200、Thermo Fisher Scientific)) を 50 分間インキュベートしました。各抗体のインキュベーション後、サンプルをIF緩衝液で15分間3回洗浄しました。核をDAPIで20分間染色し、次にDPBSで5分間3回洗浄した。

一定期間にわたる勾配の形成を追跡するために、1.5% アガロースで満たされた CUBE を、CUBE の一端にある DPBS 中の 10 μM 40 kDa フルオレセインイソチオシアネート (FITC)-デキストラン (Sigma、FD40S) を含む勾配チップに配置しました。もう一方の端には DPBS 中の 10 μM 40 kDa テトラメチルローダミン B イソチオシアネート (TRITC)-デキストラン (TdB Labs、TD40) を加えます。 24 時間ごとに、FITC デキストランと TRITC デキストランの両方を廃棄し、培地チャンバーを DPBS で 1 回洗浄してから、新しいデキストランと交換しました。これらの手順に続いて、蛍光顕微鏡 (BZX-700、Keyence) を使用して CUBE の窓 (w = 2.75 mm、h = 3.5 mm) で倍率 4 倍でイメージングを実行しました (視野: w = 3.6 mm、h = 3.5 mm)。 = 2.7 mm)。 CUBE のウィンドウ領域は、x において FITC 側の光源から 1.5 mm、TRITC 側の光源から 0.75 mm 離れていました。 CUBE の壁から y 方向に 0.75 mm 離れています。 z 方向の CUBE の底部から 2.5 mm。 FITC および TRITC 強度は、ImageJ ソフトウェアの Plot Profile ツールを使用して、画像の中心の領域 (w = 2.2 mm、h = 2.2 mm) にわたって蛍光画像から測定されました。これにより、垂直 y 軸に沿った平均強度が得られます。 X 軸の各ピクセル。次に、濃度 (C) を、さまざまな濃度の FITC-および TRITC-デキストラン強度の標準曲線に対する直線相関によって計算しました (補足データ 1)。勾配は、CUBE ウィンドウの両端の領域を除外するために、0.2 mm と 2.0 mm での濃度の比 (FITC の場合は Cx0.2/Cx2.0、TRITC の場合は Cx2.0/Cx0.2) として計算されました。 CUBE フレームへの近さはデキストランの強度に影響し、回転楕円体のおおよその領域を表すためです。

すべてのサンプルサイズは 5 より大きく、図の凡例で指定されています。 p 値は、Matlab のコルモゴロフ – スミルノフ (KS) 検定によって計算されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。図 3c と補足図 1c の基礎となるソースデータは補足データ 1 に提供されています。

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この研究は、JSPS 科研費 21H01299 および 21K18048 の資金によって支援されました。一部のイラストは Biorender を使用して生成されました。

理化学研究所先駆研究クラスター、〒351-0198 埼玉県

エリザベス・コー & キング・ハギワラ

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IK と MH はこの研究を考案し、実験を計画して実施し、結果を分析しました。 IKが原稿を書きました。著者全員が提出された原稿を読んで承認しました。

萩原雅也さんとの通信。

著者は以下の特許を保有しています。(i) CUBE デバイスに関する - 承認済み: 6877009 (日本)、US 11,155,775 B2 (米国)。保留中: 201680069487.6 (中国); 申請者：大阪首都大学、九州工業大学、発明者: 萩原正也、川原友宏、(ii) CUBE デバイスおよび流体デバイスに関する - 承認: 第 7055386 号 (日本)。保留中: 16/484,506 (米国)、16/484,506 (EP); 申請者：大阪首都大学、発明者: 萩原正也 (iii) CUBE デバイスのセクショニングに関する - 出願中: 2022-140997 (日本); 申請者: 理化学研究所; 発明者：萩原正也、イザベル・コー。特許6877009は日本医化学工業株式会社にライセンスされています。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な担当編集者: Marco Fritzsche、Manuel Breuer。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Koh, I.、Hagiwara, M. 局所分化を伴うオルガノイドの生成とイメージングのためのセクショニングへの勾配 CUBE ワークフロー。 Commun Biol 6、299 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04694-5

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受信日: 2022 年 9 月 27 日

受理日: 2023 年 3 月 10 日

公開日: 2023 年 3 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04694-5

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