心臓ミオシン結合タンパク質によるミオシンの調節

Scientific Reports volume 12、記事番号: 4337 (2022) この記事を引用

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心臓ミオシン結合プロテイン C (cMyBP-C) は、サルコメア機能の重要な調節因子です。 cMyBP-C のリン酸化の低下は、心不全患者の収縮力の低下に関連しています。 ここでは、実験的心不全（HF）における心臓の収縮と弛緩に対するcMyBP-Cの脱リン酸化状態の調節の効果を決定するためのツールとして、以前に公開されたcMyBP-Cペプチド302Aおよび302S（調節リン酸化部位セリン302の代替物）を使用しました。 ）インビトロモデル。 両方のペプチドは、cMyBP-C リン酸化アブレーション (cMyBP-CAAA) を構成的に発現するマウス モデルから単離された乳頭筋線維の収縮性を増加させました。 特にペプチド 302A は、cMyBP-CAAA (非リン酸化アラニン) マウスの乳頭筋線維における力の再発達速度 (ktr) も改善する可能性があります。 上記の発見と一致して、両方のペプチドは心筋梗塞（MI）を患ったラットから単離された筋原線維のATPアーゼ速度を増加させましたが、偽ラットからはそうではありませんでした。 さらに、cMyBP-CAAA マウス モデルでは、両方のペプチドが ATPase 加水分解速度を改善しました。 これらの変化は非トランスジェニック（NTG）マウスや偽ラットでは観察されず、HFの病的条件下でのcMyBP-Cの脱リン酸化状態の調節におけるこれらのペプチドの特異的な効果を示している。 総合すると、これらの研究は、cMyBP-C 脱リン酸化状態の調節が、心臓有害事象後のミオシン機能、サルコメア収縮性、および弛緩を改善するための治療アプローチとなり得ることを実証している。 したがって、cMyBP-C を標的にすると、心不全患者の標準治療薬を補完するものとして、全体的な心臓のパフォーマンスを改善できる可能性があります。

心臓ミオシン結合タンパク質-C (cMyBP-C) は、140 kDa の筋節の太いフィラメントタンパク質であり、筋節の C ゾーンに一定の間隔で局在して、心臓の筋節の構造と機能を調節します 1,2。 cMyBP-C の制御は、M ドメインの 3 つのリン酸化部位と、その N 末端領域とミオシンおよびアクチンの両方との相互作用によって起こります 3,4。 cMyBP-C は通常の生理学的条件下では高度にリン酸化されますが、病気の状態ではリン酸化レベルが低下します5。 これは、前臨床心不全（HF）モデルと、臨床的には肥大型心筋症（HCM）、HF、または心房細動の患者の両方で観察できます6。 cMyBP-C を標的とすることの明らかな利点にもかかわらず、心臓機能を改善するために脱リン酸化された cMyBP-C を直接修飾する薬剤は現在利用できません。

ヒトおよびマウスの cMyBP-C タンパク質には 3 つの主要なリン酸化部位があり、合計 17 部位以上あります 7,8。 これらは分子の N 末端の M ドメインに位置しており、骨格筋アイソフォームにはすべて存在しません 9。 N 末端の領域は、レバーアーム ドメインに近いミオシンの S2 セグメントに結合します10、11。 この相互作用は、cMyBP-C のリン酸化/脱リン酸化によって動的に制御できます。 生理学的条件下では、リン酸化された cMyBP-C は架橋サイクリングの活性化を促進し、太い筋節フィラメントと細い筋節フィラメントを繋ぎ止めます 12。 しかし、cMyBP-C が病的状態で脱リン酸化されると、ミオシンと強く相互作用し、アクチンとの力を生み出す相互作用が妨げられます 13、14、15。 同様に、MI 中の cMyBP-C の N 末端領域の触媒的切断により、リン酸化部位の数が減少し、心臓の収縮性と機能の低下につながります 16。

以前の研究では、正常な心機能を調節するための cMyBP-C リン酸化の必要性と十分性が決定されています 17、18、19、20。 これらの研究では、Ser-273-Ala/Ser-282-Ala/Ser-302-Ala 部位 (AAA) でリン酸化除去された cMyBP-C または Ser-2 でリン酸化模倣 cMyBP-C を発現する心臓特異的トランスジェニック (TG) マウスを使用しました。 273-Asp/Ser-282-Asp/Ser-302-Asp (DDD) と非トランスジェニック (NTG) 対照マウスとの比較。 したがって、心臓有害事象後の心機能を改善するためにcMyBP-Cを治療標的とするために、文献で報告されている前臨床モデルを使用しました。 最初のモデルでは、3 つのセリンリン酸化部位 (273、282、および 302) がすべて非リン酸化可能アラニン (AAA) に変異しました18。 別のモデルでは、心臓の生理学的状態を模倣するために、それらをリン酸化模倣アスパラギン酸 (DDD)19 に変異させました。 AAA 置換は心機能の低下をもたらし、そのタンパク質は cMyBP-C ヌル表現型をレスキューできませんでした 18 が、DDD 置換は cMyBP-C ヌル表現型をレスキューできました 19。 cMyBP-C野生型を発現したトランスジェニックマウスをNTGコントロールとして使用した。

ここでは、cMyBP-C21 の M ドメインに基づいて設計されたペプチドをテストしました。 我々は、これらのペプチドが cMyBP-C とミオシンの相互作用を妨害し、ミオシンヘッドと細いフィラメントの相互作用、ひいてはパワーストロークを改善する可能性が高いと仮説を立てました。 試験したcMyBP-Cペプチドは、cMyBP-Cとミオシンの間の緊密な相互作用を破壊し、太いフィラメントを解放して細いフィラメントとの相互作用を再開し、筋肉の収縮性を改善する可能性があります。 実際、302のリン酸化部位の代替ペプチドである302Aを透過化すると、ミオシンがcMyBP-Cと相互作用するのが阻害され、その結果ミオシンがアクチンに向かって移動し、その結果アクトミオシン相互作用と架橋が形成され、収縮性が増強された。 総合すると、ペプチド 302A の in vitro での評価により、心筋線維における力の発生とカルシウム感受性が改善されたことが発見されました。 しかし、cMyBP-C のリン酸化状態と比較した収縮動態の改善の根底にあるメカニズムは完全には解明されていません。 病理学的条件下では、上で示唆したように、ペプチド 302A が脱リン酸化状態の cMyBP-C の結合特性を改変して心臓動態を改善するという仮説を立てました。 この仮説を検証するために、cMyBP-C ペプチド 302A および 302S の効果を 3 つの異なる in vitro アッセイ、すなわち定常状態 ATPase アッセイ、筋原線維 ATPase アッセイ、および乳頭筋アッセイで評価しました。 in vitro アッセイおよび前臨床 HF モデルから生成されたデータは、cMyBP-C を調節し、その結果としてそのリン酸化状態を調節すると、ATPase 活性と力の動態が増加し、全体的な心臓のパフォーマンスが向上するという強力な証拠を提供します。

MI-HF ラットモデルに対する cMyBP-C リン酸化状態の影響をテストするために、MI ラットの左心室 (LV) 梗塞領域と、MI 手術後の 5 つの異なる時点で偽動物からの同等の領域からタンパク質サンプルを収集しました。 ：1日目、3日目、1週目、4週目、8週目。MI手術後の4つの時点（3日目、1週目、4週目、8週目）で全体的な心臓機能パラメータを測定し、心不全の発症を確認した。 （補足図S1）。 cMyBP-Cのリン酸化は、位置273、282、および302のセリンリン酸化部位を特異的に標的とする抗体、および総cMyBP-C発現レベルを検出する抗体を使用して検出されました（図1、補足図S2〜7）。 α-アクチンは、1 日目と 3 日目の正常化のためのハウスキーピング タンパク質として使用されました。HPRT は、α-アクチンの大幅な減少のため、MI 後 1 週目、4 週目、および 8 週目の正常化のためのハウスキーピング タンパク質として使用されました。 MI後1週目のレベル（補足図S8）。 この発見は、3 つのリン酸化セリン残基 (p273、p282、および p302) とともに総 cMyBP-C の発現レベルが初期の時点 (1 日目および 3 日目) で大幅に減少し、その後、次の時点で減少傾向が続いたことを示唆しています。 MI後1週目のサンプル（図1、補足図S2〜S5）。 驚くべきことに、8週目のp273を除き、3つのリン酸化部位すべての発現が後の時点（MI後4週目および8週目のサンプル、補足図S2）で増加しました。これはおそらくHFの進行に伴う代償効果の結果です。 私たちは、総cMyBP-Cの発現がcMyBP-Cリン酸化変化の傾向に密接に従うことに気づきました（図1、補足図S2）。これは、心臓損傷の主な影響が総cMyBP-C発現にあったことを示しています。 したがって、総 cMyBP-C 発現に対する cMyBP-C リン酸化部位 (p273、p282、および p302) の比率を計算しました (補足図 S8)。 cMyBP-C 部位 (p273 および p282) の総 cMyBP-C に対するリン酸化は、MI 後 1 日目では変化していませんでしたが、3 日目、1 週目、4 週目に 3 つのリン酸化部位 (p273、p282、および p302) のすべてで有意に増加しました。心筋梗塞後8週目と偽との比較。 さらに、トロポニン T とトロポニン I の発現もテストしましたが、これもすべての時点で一貫した減少を示しました（補足図 S9）。 興味深いことに、ミオシン重鎖 (MHC) の発現低下は遅れて起こり、MI 後 3 日目にのみ観察されました。 MHC発現の迅速な代償は、後の時点で劇的に増加しました（MI後4週目および8週目;補足図S9）。

cMyBP-Cリン酸化は、偽と比較して、MI後ラットでは1日目と3日目に減少しましたが、1週目では減少しませんでした。 (A) 部位特異的リン酸化 cMyBP-C 抗体 p273、p282、p302、総 cMyBP-C 抗体、およびハウスキーピング タンパク質抗体 α-アクチンまたは HPRT を使用してテストしたリン酸化 cMyBP-C のウェスタンブロット (Wes)。 MIラットの左心室梗塞組織からの全ホモジネートと偽ラットの同じ領域をWesに使用した。 各レーンは、同量のタンパク質がロードされた 1 つの個別のキャピラリーを表します。 元の全長のWes画像を補足図に示します。 S3～S5。 (B) ハウスキーピングタンパク質に対して正規化された cMyBP-C p273、p282、および p302 の定量。 データは平均値 ± SEM (N = 6 ～ 8) を表します。 **p < 0.01; ***p < 0.005; ****p < 0.001; 対応のない両側スチューデントの t 検定。

ヒトHFにおけるcMyBP-Cのリン酸化状態を試験するために、正常な健康なドナー、ならびに肥大型心筋症（HCM）および拡張型心筋症（DCM）患者からの心臓組織切片を使用して免疫組織化学（IHC）を実施した（1グループあたりN = 4人の患者） 、図２Ａ）。 HCM および DCM サンプルは訓練を受けた生理学者によって確認されました。 IHCは、p273およびp282に対する抗体、ならびに総cMyBP-Cに対する抗体を使用して実施した。 p273の相対発現は、HCMの心臓組織ではわずかに減少したが、DCM患者では減少しなかった(正常0.72±0.08対HCM0.48±0.06、p=0.06;DCM0.78±0.10;n=16;図2B)。 一方、p282 の相対発現は、HCM 患者と DCM 患者の両方で有意に減少しました (正常 1.64 ± 0.16 対 HCM 0.93 ± 0.06、p < 0.005; 正常 1.64 ± 0.16 対 DCM 1.04 ± 0.11、p < 0.01)。 したがって、ヒト患者からの IHC データは、ヒト HF における cMyBP-C リン酸化の減少を強く裏付けました。

HCM および DCM 患者の心臓組織切片の免疫組織化学では、健康なドナーと比較して cMyBP-C リン酸化の減少が示されました。 (A) 正常、HCM、および DCM 心臓サンプルにおける p273 および p282 の IHC 画像。 (B) すべての心臓サンプルにおける p273 および p282 の対応する定量。 p273 および p282 値は、総 cMyBP-C 値に対して正規化されました。 データは平均 ± SEM (N = 4 人の患者、n = 16 枚の画像) を表します。 図中のスケールバーは 20 μm を表します。 DCM、拡張型心筋症。 HCM、肥大型心筋症: IHC、免疫組織化学。 **p < 0.01; ***p < 0.005; Tukey ポストテストを使用した一元配置分散分析。

cMyBP-Cの調節におけるcMyBP-Cペプチド302Aおよび302S(表1)の効果を、3つの異なるインビトロアッセイで試験した。 定常状態 ATPase アッセイには、ミオシン、アクチン、全長 (FL) cMyBP-C、または切断型 C0-C2 組換えタンパク質 (非リン酸化 [-P] またはリン酸化 [+P]) が含まれていました。 ATPase 活性は、ATP 加水分解によって放出される Pi を検出することによって測定されました。 ミオシン ATPase 活性の阻害は、C0-C2 および FL cMyBP-C タンパク質の両方の濃度が増加するにつれて観察されました (図 3A、C)。 FL cMyBP-C タンパク質と比較した場合、C0-C2 は ATPase 活性の阻害においてはるかに強力でした (3.16 ± 0.18 対 6.66 ± 0.11 μM)。 リン酸化タンパク質、C0-C2またはFLのいずれかは阻害曲線を右にシフトさせましたが、302Aペプチドも302Sペプチドもさまざまな濃度で試験したミオシンATPアーゼ活性を増強しませんでした（図3B、D）。 これらの結果は、ペプチドの存在下での組換えサルコメアタンパク質ミオシンおよびアクチン単独では、ATPアーゼ活性に影響を与えてサルコメア機能を可能にするのに十分ではない可能性があることを示唆しています。 むしろ、cMyBP-C ペプチドは、より発達した無傷なサルコメア構造の存在下でのみ機能し、in vitro で ATPase 活性を増強する可能性があります。

cMyBP-C ペプチドは、短縮型 cMyBP-C C0C2 または FL cMyBP-C を使用した定常状態の ATPase アッセイに影響を与えません。 (A) 脱リン酸化 FL cMyBP-C は、リン酸化 cMyBP-C によるミオシンの阻害よりもミオシン ATPase 活性を阻害しました。 (B) cMyBP-C 302A または 302S ペプチドは、ミオシン ATPase FL cMyBP-C 活性に影響を与えませんでした。 (C) 脱リン酸化 cMyBP-C C0-C2 はミオシン ATPase 活性を阻害しましたが、リン酸化 cMyBP-C は阻害しませんでした。 (D) cMyBP-C ペプチド 302A または 302S は、CO-C2 ミオシン ATPase 活性に影響を与えませんでした。 データは平均値 ± SEM (N = 4 ～ 12) を表します。 FL、フルレングス。 Scr、スクランブル。

無傷のサルコメアを用いてATPアーゼ活性に対するcMyBP-Cの役割をさらに調べるために、サルコメアタンパク質が天然の状態で存在する偽ラットおよびMI後1週目のラットの心臓サンプルから筋原線維を単離した。 ゲル電気泳動を使用して、MHC、cMyBP-C、アクチニン、トロポニン T、α-トロポミオシン、およびミオシン軽鎖 (MLC) タンパク質を含むすべての主要な筋原線維タンパク質の存在を検証することで、完全に無傷なサルコメアの完全性が確認されました (補足図S10A）。 他の主要な機能を変更することなく、偽動物から単離された筋原線維と比較して、MI後1週間の筋原線維におけるcMyBP-C p273、p282、およびp302のリン酸化の一貫した減少が観察されました（補足図S10B〜D、S11）。サルコメアタンパク質（補足図S10E、F）。 次に、ペプチドが無傷のサルコメアタンパク質と相互作用できる筋原線維ATPアーゼアッセイでcMyBP-Cペプチドの効果を評価しました（図4）。 偽または MI 遠隔領域から単離した筋原線維タンパク質と比較して、MI 梗塞領域から単離した筋原線維タンパク質ではミオシン ATPase 活性の有意な低下が観察されました (偽 159.8 ± 12.59 対 MI 遠隔 144.1 ± 9.81 対 MI 梗塞 67.8 ± 12.18 、ｐ＜０．００５、図４Ａ）。 一方、ペプチド (スクランブル、302A または 302S) はいずれも、偽心臓からの筋原線維タンパク質に対して効果を示さなかった (図 4B)。 逆に、cMyBP-C ペプチド 302A および 302S ペプチドは、MI 後 1 週間目の梗塞心臓の筋原線維における最大 ATPase 活性を 60.9 ± 5.3 nmol Pi/min/mg (偽、n = 15) から 87.9 ± 7.1 nmol Pi/min/mg に改善しました。それぞれ、分/mg (302A、n = 12; p < 0.05) および 91.3 ± 6.2 nmol Pi/分/mg (302S、n = 12; p < 0.05) (図 4C)。

筋原線維ATPアーゼ活性は、MI後ラットでは1週目にcMyBP-Cペプチド302Aおよび302Sによって増加しましたが、偽ラットでは増加しませんでした。 (A) ATPase 活性は、偽心臓からの筋原線維と比較して、MI 梗塞領域からの筋原線維では 50% 以上減少しましたが、MI 遠隔領域からの筋原線維では変化しませんでした (左)。 筋原線維 ATPase 活性は、アッセイで使用した筋原線維タンパク質によって正規化されました。 pCa 2.0 での最大 ATPase 活性を棒グラフ (中央) にプロットしました。 pCa50 も、カルシウム感受性をテストするためにプロットされました (右)。 (B) cMyBP-C ペプチド 302A および 302S は、偽ラットから単離された筋原線維における最大 ATPase 活性を変化させませんでした (左および中央)。 偽サンプルのどの治療グループでもカルシウム感受性の変化は認められませんでした（右）。 (C)cMyBP-Cペプチド302Aおよび302Sは、未処理対照およびスクランブルペプチド処理筋原線維と比較して、MI後1週目のラットの梗塞領域から単離された筋原線維における最大ATPアーゼ活性を増加させた(左および中央)。 MI サンプルのどの治療グループでもカルシウム感受性に変化は見られませんでした (右)。 データは平均値 ± SEM (N = 8 ～ 15) を表します。 *p < 0.05; ***p < 0.005; Tukey ポストテストを使用した一元配置分散分析。 MI、心筋梗塞。

次に、cMyBP-C AAA および DDD トランスジェニック マウス モデルから単離された筋原線維における ATPase 活性と cMyBP-C の役割を調査しました (図 5)。 ミオシン ATPase 活性は、NTG (93.98 ± 7.85 nmol Pi/min/mg、p < 0.01) および AAA (71.06 ± 6.25 nmol Pi) の筋原線維と比較して、DDD マウスの筋原線維 (131.2 ± 9.33 nmol Pi/min/mg) で有意に上方制御されました。 /分/mg)マウス(図5A)。 偽データと一致して、どのペプチド（スクランブル、302Aおよび302S）も、NTGマウスの筋原線維におけるATPアーゼ活性を改善しなかった（図5B）。 一方、302A ペプチドと 302S ペプチドは両方とも、最大 ATPase 活性が 62.74 ± 4.27 nmol Pi/min/mg (コントロール、n = 11) および 58.58 ± 6.67 nmol Pi/min/mg (スクランブル、n = 10) から94.29 ± 11.01 nmol Pi/min/mg (302A、n = 10) および 95.05 ± 10.02 nmol Pi/min/mg (302S、n = 10)。スクランブルより 61% (302A) および 62% (302S) の増加を示します。 、それぞれ（図5C）。 cMyBP-C 302A ペプチドも 302S ペプチドも、MI または AAA 前臨床 HF モデルにおけるカルシウム感受性に影響を与えませんでした。

NTGおよびTGマウスにおけるcMyBP-Cペプチド302Aおよび302Sの効果。 (A) ATPase 活性は、NTG マウスと比較して DDD TG マウスの方が高くなります。 AAA TG マウスでは ATPase 活性が低下しました (左)。 pCa 2.0 での最大 ATPase 活性を棒グラフにプロットしました (中央)。 pCa50 も、カルシウム感受性をテストするためにプロットされました (右)。 (B) cMyBP-C ペプチド 302A も 302S も、偽マウスから単離された筋原線維における最大 ATPase 活性を変化させませんでした (左および中央)。 偽サンプルでは、​​どの治療グループでもカルシウム感受性に変化は見られませんでした（右）。 (C) cMyBP-C ペプチド 302A および 302S は、未処理対照またはスクランブルペプチド処理筋原線維と比較して、トランスジェニック マウスから単離された筋原線維における最大 ATPase 活性を増加させました (左および中央)。 TG サンプルのどの治療グループでもカルシウム感受性の変化は認められませんでした (右)。 データは平均値 ± SEM (N = 8 ～ 15) を表します。 *p < 0.05; ***p < 0.005; Tukey ポストテストを使用した一元配置分散分析。 TG、トランスジェニックマウス。

私たちは、筋原線維からの発見を拡張して、cMyBP-C合成ペプチドがサルコメア機能に影響を与えるかどうかを判断するために、生体内状態に近い乳頭筋を調査しました。 これを達成するために、生後 3 か月の AAA および DDD マウスの心臓の乳頭筋における pCa と力の関係を、年齢を一致させた NTG コントロールと比較して測定しました (図 6)。 NTG および DDD 線維と比較して、AAA 線維は pCa 4.5 での最大力の発現に重大な欠陥を示し、さらにカルシウム感受性の大幅な低下を示し、筋フィラメントレベルでの機械的欠陥を示唆していることがわかりました（図 6A-E）。 筋原線維ATPアーゼ活性の測定と一致して、25μMまたは50μMの302SペプチドとのインキュベーションはAAA乳頭線維における力生成を有意に改善し、302Aペプチドも力を増加させたが、有意ではなかった（p = 0.0514）（図6D、補足図S12A）。 ）。 302S ペプチドと 302A ペプチドは両方とも、AAA 線維におけるカルシウム感受性の改善に顕著な有効性を示しました（図 6E、補足図 S12B）。 また、リン酸化模倣 cMyBP-C ペプチド 302D もテストしましたが、NTG、AAA、または DDD 乳頭線維のいずれにおいても力の生成は改善されませんでした（補足図 S13）。 心機能に対する 302A および 302S ペプチドの効果をさらに特徴付けるために、弛緩の間接的な尺度として力の再開発速度 (ktr) 測定を実行しました。 302Aペプチドはktr活性を改善したが、302Sペプチドは改善しなかった。これは、後者が弛緩ではなく収縮性にのみ影響を与えることを示している（図6F）。 ktr に対する改善された効果は、25 μM の 302A ペプチドでも観察されました (補足図 S12C)。

心機能は、AAAトランスジェニックマウスから単離された筋線維においてcMyBP-Cペプチド302Aおよび302Sによって改善されたが、NTGまたはDDD TGマウスでは改善されなかった。 異なるペプチド (50 μM) の存在下でサルコメア長 2.0 μM で生成された pCa 曲線 (A ～ C) を強制します。 最大力生成 (D、mN/mm2)、カルシウム感受性 (E、pCa50)、および力再生速度 (F、ktr) を、NTG (白いバー)、AAA (赤いバー) と DDD (緑のバー)。 N = グループあたり 4 匹の動物からのペプチド処理あたり 4 つの乳頭線維。 *p < 0.05 Tukey 事後検定による一元配置分散分析。 AAA、非リン酸化アラニン。 DDD、リン模倣アスパラギン酸。 NTG、非トランスジェニックマウス。 Scr、スクランブル。

cMyBP-C は、心筋症や心不全の発症に直接関連する MYBPC3 遺伝子の 300 以上の変異を備えた心収縮性の重要な調節因子です 22,23。 cMyBP-C のリン酸化は、前臨床および臨床モデルの病理学的条件下で大幅に減少することが示されていますが、cMyBP-C 発現の動的な変化と、さまざまな時点での心臓動態におけるその重要性は報告されていません。 この研究では、ラット MI モデルにおける HF 発症時の cMyBP-C 脱リン酸化の動態を特徴付けました。 cMyBP-Cのリン酸化は、心臓損傷後1週間以内（MI後1日目および3日目、図1）に大幅に減少しましたが、その後の時点（MI後4週間および8週間、補足図S2）で大幅に増加しました。 、心臓における代償効果を示唆しています。 総 cMyBP-C も、MI 前臨床 HF モデルのさまざまな時点で減少しました。 これらの発見は、cMyBP-C のリン酸化状態は一時的なものであり、cMyBP-C の総発現量の減少と組み合わせると、HF の発症に寄与することを示唆しています。 したがって、前臨床動物モデルからの発見に基づいて、関連する時点での病原性脱リン酸化状態にある cMyBP-C を標的とする介入戦略の有用性を仮説を立てました。 血流中の総 cMyBP-C の急性損失は以前の研究と一致しており、cMyBP-C が MI の潜在的な診断バイオマーカーおよび HF24 の予後マーカーとして機能する可能性があることを示唆しています。 ヒトの HCM および DCM 患者では、cMyBP-C のリン酸化が疾患の進行の進行と関連しています 25,26。 HCM 患者では、p273 と p282 の両方が減少しました (図 2)。 cMyBP-C リン酸化部位の階層が報告されています 20。 Ser-282 は、そのリン酸化がその後の Ser-302 のリン酸化に重要であるという点で、独特の調節的役割を持っています。 cMyBP-C機能におけるその重要性に関連して、DCM患者とHCM患者の両方でser-282リン酸化の減少が観察されました（図2）。 Ser-273 は、非生理的カルシウム濃度下で主に PKA と CAMKII によってリン酸化される ser-282 とは異なり、プロテインキナーゼ A (PKA) とプロテインキナーゼ C (PKC) の両方によってリン酸化されます。 DCM 患者では、ser 273 リン酸化に影響を与える可能性のある PKA および/または PKC ダイナミクスの代償の可能性があります。 したがって、これは DCM 患者には最小限の影響しか及ぼさない可能性がありますが、HCM 患者には影響しません。 ser-282 と ser-302 は両方とも cMyBP-C の動態の加速に関与しており、CAMKII によってリン酸化されます。 ser282 リン酸化を除去すると、CAMKII による ser-302 リン酸化が減少することが示されています。 患者サンプルが限られていたため、p302 は検査されませんでしたが、我々のデータは、HCM 患者と DCM 患者では異なるリン酸化部位が影響を受ける可能性があることを示しました。

cMyBP-C のリン酸化の減少は、心不全患者の収縮力の低下に関連しています 27。 ここでは、cMyBP-C の脱リン酸化状態を調節することで実験的心不全 (HF) における心臓の収縮と弛緩を改善できるかどうかを判断するツールとして、調節リン酸化部位セリン 302 の代替物である、以前に公開された cMyBP-C ペプチド 302A および 302S21 を使用しました。モデル。 したがって、cMyBP-Cの調節に対するペプチドの効果を完全に特徴付けるために、我々は、定常状態ATPアーゼアッセイ、筋原線維ATPアーゼアッセイ、および乳頭筋アッセイという3つの異なる組換えインビトロおよびエクスビボアッセイでペプチドを評価した。 定常状態の ATPase アッセイでは、どの治療グループでも ATPase 活性の変化は観察されませんでした (図 3)。 しかし、筋原線維タンパク質が疾患モデル、すなわちラットMIモデルまたはマウスcMyBP-CAAAモデルから単離された場合、ATPアーゼ活性の一貫した改善が302Sおよび302Aペプチド処理群で観察されました（図4、5）。 このATPアーゼ活性の改善は、cMyBP-CAAAトランスジェニックマウスから単離した乳頭筋線維を用いた収縮性の改善と一致していた(図6)。 これらのデータを総合すると、病的状態下での cMyBP-C 標的療法を評価する必要性が示されました。 さらに、上記の発見は、cMyBP-C動態と心臓機能の調節におけるその役割を適切に捕捉するペプチドの活性には、無傷のサルコメアが必要であることを強く示唆した。 ペプチドの透過性が限られているため、無傷の心筋細胞またはサルコメア上でのペプチドの免疫局在化は不可能でした。

cMyBP-Cの発現またはリン酸化の低下を示したHFモデルに対するペプチドの心臓効果の改善が観察されたため、ペプチドがおそらくcMyBP-Cとミオシンの相互作用を遮断し、それによってミオシンヘッドと細いフィラメントの相互作用が改善されたのではないかという仮説を立てました。したがって、パワーストローク。 生理学的条件下（NTG/DDDまたは正常）では、リン酸化cMyBP-Cは架橋サイクリングの活性化を促進し、太いサルコメアフィラメントと細いサルコメアフィラメントを繋ぎ止めます（図7;左パネル）。 しかし、cMyBP-Cが病的状態（AAAまたはHF）で脱リン酸化されると、ミオシンと強く相互作用し、そのため力を生み出すアクチンとの相互作用が妨げられます（図7;中央パネル）。 私たちがテストしたcMyBP-Cペプチドは、cMyBP-Cとミオシンの間の緊密な相互作用を破壊し、太いフィラメントを解放して細いフィラメントとの相互作用を再開し、筋肉の収縮性を改善する可能性があります（図7、右パネル）。

アクトミオシン相互作用に対するcMyBP-Cのリン酸化状態の影響と、架橋形成の状況におけるcMyBP-Cペプチド302Aおよび302Sの影響を示す図。 リン酸化が存在しない場合 (上)、cMyBP-C のアクチン結合部位の位置は、細いフィラメントから約 3 nm の位置にあります。 cMyBP-C (中央) のリン酸化は、細いフィラメントの表面まで架橋を拡張し、それによってミオシン分子のロッド部分のパッキングを緩めると考えられます。 透過化302AペプチドはミオシンがcMyBP-Cと相互作用するのを阻害し（下）、アクチンへの移動をもたらし、その結果アクトミオシン相互作用と架橋が形成され、収縮性が増強されます。

cMyBP-C リン酸化の関連性は、リン酸化部位のセリンを置換して活性化 cMyBP-C を模倣することにより、DDD トランスジェニック マウス モデルなどの複数のトランスジェニックげっ歯類モデルで報告されています 18,19。 cMyBP-C のリン酸化部位の減少は、タンパク質発現の減少に寄与する可能性があります。 ここで、我々は、そのようなリン酸化の減少が総cMyBP-C発現の減少と相関していることを観察しました（図1）。 最近、心臓機能を改善するための MYBPC3 cDNA の送達に関する研究が報告されています。 AAV9を保有するMYBPC3 cDNAを単回全身投与すると、MYBPC3標的ノックインマウスにおいてcMyBP-Cがわずか20％でMYBPC3のmRNAとタンパク質のレベルを回復し、左心室肥大（LVH）の発症を防ぐことができたことが報告されている。プロテイン28. 別の研究では、AAV6 を保有する MYBPC3 cDNA が、操作された 3D 心臓組織において同様の改善を達成できたと報告しました 29,30。 さらに、AAV9 を保有する MYBPC3 cDNA は、HCM 患者由来のヒト iPSC 由来心筋細胞の肥大の進行を抑制することが示されています 31。 しかし、治療法としての AAV9 の継続使用には、細胞および全身の性質、用量と曝露の関係、曝露と反応の関係、さらにはこれらの重要な特性に対する免疫原性の影響に関する知識が不足しているため、欠点が生じる可能性があります 32。 したがって、cMyBP-C とそのタンパク質間相互作用を標的とする特定の分子の探索は、効果的な治療法をベンチからベッドサイドまでもたらすために重要です。 私たちの研究は、cMyBP-C ペプチドの低い透過性と安定性によって制限され、筋原線維タンパク質と透過性乳頭筋線維を使用する in vitro および ex vivo 設定にアッセイを制限していました。 したがって、透過性ペプチドと優れた安定性を備えた in vivo 環境でのさらなる研究により、心機能における cMyBP-C 調節のメカニズムをより包括的に理解できるようになります。

心筋梗塞 (MI) ラットモデルは以前に特徴付けられています 33。 生後8～10週、体重180～250gの28匹の雄Sprague-Dawley（SD）ラット（Charles River Laboratories、マサチューセッツ州ウィルミントン）を使用して、左冠動脈前下行枝（LAD）によるMIを誘発した。結紮。 私たちは、動物の取り扱いに関して研究全体を通じて ARRIVE ガイドラインに従いました。 すべての手順は、米国ニュージャージー州ケニルワースにあるメルク社の実験動物の使用と管理に関する施設内倫理委員会によって承認されました。 簡単に言えば、動物は麻酔下で左側開胸術を受けた。 心膜嚢を切開し、LADを同定した。 冠状動脈オクルーダーを起点から約 2 mm 下の LAD の周囲にゆるく配置し、オクルーダーを引っ張って冠状動脈を結紮しました。 梗塞は、左心室の白化および変色およびＥＣＧ上のＳＴ上昇によって定義された。 それから胸が閉じられました。 手術後、動物は外科的合併症がないか注意深く監視されました。 同様の年齢および体重を有する２３匹の雄ＳＤラットを、心臓にアクセスし創傷を閉鎖するために同様の開胸術を受けたが、ＬＡＤ結紮は行わなかった偽動物として割り当てた。 梗塞を確認するための MI 後の評価は、3 日目、1 週目、4 週目、および 8 週目に心エコー検査によって実行されました。一方、以下の全体的な心臓機能パラメーターが測定されました: LV 収縮末期および拡張期内径 (mm)、LV 収縮末期および拡張期内径 (mm)拡張期容積（μL）、一回拍出量（μL）、心拍出量（mL/min）、心拍数（BPM）（補足図S1）。 小さいサイズの梗塞および駆出率（EF）> 40%を有する動物は研究から除外された。 4 つの終了時点は​​、3 日目、1 週目、4 週目、および 8 週目でした。各終了時点で、ラットに麻酔をかけ、心臓を切除し、液体窒素中で急速冷凍し、使用するまで -80 °C で保存しました。 。

以前に記載された、α-ミオシン重鎖プロモーターを備えたcMyBP-Cの心臓特異的トランスジェニックリン酸化アブレーション(AAA)およびリン酸化模倣(DDD)マウスモデルを使用して、複数系統のFVB/Nマウスを作製した18、19、34、35。 簡単に説明すると、cMyBP-C 上の既知の重要なリン酸化部位 (Ser-273、Ser-282、Ser-302) と、隣接する 2 つの潜在的な代替リン酸化部位 (Thr-272 および -281) が、アラニン (A) とアスパラギン酸に変換されました。 (D) 標準的な PCR ベースの方法を使用した残基。 すべての実験は施設のガイドラインに従って実施され、シンシナティ大学動物管理使用委員会によって承認されました。 この研究では、12〜14週齢の男女混合成体マウスを使用しました。

cMyBP-C 阻害剤ペプチドは、米国ニュージャージー州ケニルワースにある Merck & Co., Inc. の研究所で合成されました。 すべてのペプチドは、高分解能質量分析により、90% 付近またはそれ以上の純度値と、配列に基づいて予想される値と一致する正確な質量値を確認したことが確認されました。 この研究で使用した 4 つの元のペプチドの配列を表 121 に示します。純度分析と精密質量分析は、ウォーターズ ACQUITY I クラス液体クロマトグラフ (ウォーターズ、マサチューセッツ州ミルフォード) を使用した逆相 LC-UV/MS によって同時に実施しました。 ESI + イオン化モードで動作する Xevo G2-XS QTOF 質量分析計を使用。 Waters BEH C18、1.7 μm、130 Å、2.1 × 150 mm 固定相 (部品番号 186003556) を、蒸留水 (dH2O) 中の 0.1% トリフルオロ酢酸 (A) およびアセトニトリル中の 0.1% トリフルオロ酢酸 (B) 移動相とともに使用しました。 。 カラムを 55 °C で等温に保ち、流量 0.4 mL/min を使用して 25 分間にわたって 5 から 55 % B までの直線勾配を与えました。

3 つのセリン残基 (p273、p282、p302) における cMyBP-C M ドメインのリン酸化レベルは、ウエスタン免疫測定法 (Wes) 手順 (ProteinSimple、カリフォルニア州サンタクララ) を使用して、MI 手術を受けた SD ラットで測定されました。 左心室梗塞組織を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補充したRIPA緩衝液(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA)中で溶解した。 タンパク質の推定は、キット (Pierce™ BCA Protein Assay Kit 23225、Thermo Fisher Scientific) に従って実行されました。 サンプルは、ProteinSimple の推奨事項に従って、Wes プロトコルに従って調製されました。 発現研究に使用した抗体は次のとおりです: Anti-cMyBP-C p273 (1:250)、cMyBP-C p-282 (1:250)、cMyBP-C p302 (1:250) (すべて材料譲渡契約を通じて提供)シンシナティ大学医学部サクティベル・サダヤッパン教授より）。 cMyBP-C 合計 (Santa Cruz Cat # SC-137182、Lot # E2913 [Wes の 1:5]); ミオシン重鎖 (Abcam ab207926 (3-48G5C7)、アルファ (心臓) アクチン (Sigma-Aldrich A9357 クローン AC1-20.4.2)、トロポニン I (Cell Signaling 13083S [D6F8])、およびトロポニン T (Sigma-Aldrich T6277 クローン) JLT-12) データは、ロードされたタンパク質の量に一致するように、ハウスキーピング タンパク質 α-アクチンまたはヒポキサンチン ホスホリボシル トランスフェラーゼ (HPRT) の発現に対して正規化されました。

IHC 研究は、成人患者 (正常被験者、HCM 患者、および DCM 患者) からの心臓の連続組織切片を使用して実施されました。 すべての方法は、Nanjing KeyGen BioTech Co., Ltd. および Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. のガイドラインと規制に従って実行されました。すべての実験プロトコルはガイドラインと規制に従って実行され、付属ドラムタワー病院、医療機関によって承認されました。南京大学の学部。 南京大学医学部附属鼓楼病院により、すべての被験者および/または法的保護者からインフォームドコンセントを得た。 簡単に説明すると、組織切片をキシレンで脱パラフィンし、段階的アルコール洗浄で再水和した後、ペルオキシダーゼブロック（3% H2O2-メタノール）とともに室温で10分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害しました。 リン酸緩衝食塩水 (PBS) で洗浄した後、検出試薬の非特異的結合を防ぐために、切片を 1% ウシ血清アルブミン (BSA、50 ～ 100 μL) で室温で 1 時間ブロックしました。 PBS で洗浄した後、切片を一次抗体 (50 ～ 100 μL、カスタムメイド ウサギ ポリクローナル抗体 [GenScript, Piscataway, NJ]): p-273 (AFRRTpSLAGAGC)、p282 (GAGRRTpSDSHEDAC)、および総タンパク質 (AFRRTSLAGAGC) とインキュベートしました。 ) 4 °C の湿潤チャンバー内で一晩保管します。 洗浄後、切片をエンハンサー (50 ～ 100 μL) とともに室温で 20 分間インキュベートし、PBS で洗浄しました。 次いで、切片をＩｍｍＰＲＥＳＳ ＨＲＰ ＰＬＵＳポリマー（マウス／ウサギ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）とともに室温で２０分間インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄した。 次に、3,3'-ジアミノベンジジン (DAB) 色原体と基質の混合物を室温で約 3 ～ 5 分間加えて、適切な発色を可能にしました。 次いで、切片を水で洗浄することによって反応を停止させた。 次いで、切片をヘマトキシリンで15分間対比染色し、水ですすいだ。 最後に、切片を段階的アルコール洗浄で脱水し、最後にキシレン洗浄を行った。 中性バルサムを使用してセクションをカバーしました。 染色されたスライドを倍率 200 倍または 400 倍の顕微鏡で画像化し、タンパク質発現を評価しました。 リンタンパク質の陽性発現は、総面積に対する陽性領域の比率によって決定され、総タンパク質発現の値を使用して正規化されました。

定常状態の ATPase アッセイは、比色法を使用して無機リン酸放出を測定することによって実行されました。 ATPase 反応は、15 mM Tris-HCl、pH 7.5、10 mM KCl、2 mM MgCl2、および 0.1 mM EGTA からなる反応バッファー中で実行されました。 ミオシンおよび FL cMyBP-C および C0-C2 ドメインは、参考文献 36、37 に従って改変を加えて、米国ニュージャージー州ケニルワースにある Merck & Co., Inc. の研究所で作製されました。 アクチンは、同じ研究所でウサギの骨格筋からわずかな変更を加えて作られました 38,39。 アッセイで使用したすべてのタンパク質は反応バッファーで希釈しました。 FL または切断型 cMyBP-C (C0-C2)、ミオシン (1 μM)、F-アクチン (10 μM)、および ATP (2 mM) を添加して 30 μL の反応をセットアップしました。 F-アクチンは、50 mM KCl および 2 mM MgCl2 を添加し、続いて短時間ボルテックスし、重合のた​​めに氷上で 30 分間インキュベートすることによって G-アクチンから調製しました。 気泡を減らすためにプレートを 2000 rpm で 15 秒間回転させ、反応プレートを 37 °C で一定に振盪しながら 60 分間インキュベートしました。 タンパク質を水で希釈(1:20)することにより反応を停止させた。 1:20 反応混合物 30 μL を新しいプレートに移し、キットの説明書 (Abcam ab65622、Waltham、MA) に従って水を加えて 200 μL にしました。 リン酸標準もキットの説明書に従って調製しました。 最後に、30 μL の検出試薬をすべての標準ウェルとサンプルウェルに添加し、一定に振盪しながら室温で 30 分間インキュベートし、SpectraMax (Molecular Devices、カリフォルニア州サンノゼ) で 650 nm のエンドポイントで読み取りました。

筋原線維 ATPase 活性は、無機リン酸放出を測定することによって決定されました 40。 以前に報告されているように 41,42 、筋原線維タンパク質を単離および精製し、500 mM NaCl を含む F60 緩衝液に懸濁しました。 これらのタンパク質は、MI 後 1 週間の心臓サンプルと偽ラットの心臓サンプル、および cMyBP-C トランスジェニック マウス (NTG、AAA、および DDD) の心臓サンプルから抽出されました。 次に、SDS-PAGEゲルのクーマシーブルー染色（Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア州ハーキュリーズ）によってタンパク質を測定しました（補足図S10）。 反応混合物には、0.25 ～ 0.5 mg/mL の筋原線維タンパク質、15 mM Tris-HCl、10 mM KCl、2 mM MgCl2、0.5 mM EGTA、および 5 mM ATP (pH 7.0) が含まれていました。 アッセイは、96 ウェル マイクロタイター プレートで、37 °C で 8.0 ～ 2.0 の pCa2+ 濃度 (pCa) で実行されました。 120 μL の反応混合物を 37 °C で 15 分間インキュベートし、1500 rpm で 3 分間遠心分離しました。 上清 30 μL を新しい 96 ウェル マイクロタイター プレートに移し、蒸留水 (dH2O) 170 μL と混合しました。 30 µL の検出試薬 (リン酸アッセイキット、Abcam) を加えて反応を起こして発色させた後、無機リン酸の生成をキネティックマイクロプレートリーダー (Molecular Devices) を使用して 625 nm で比色定量的に測定しました。 カルシウム刺激による ATPase 活性は、pCa 8.0 での活性から pCa 2.0 での活性を差し引くことによって計算されました。

心臓全体を迅速に切除し、1×Krebs-Henseleit緩衝液（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州）で洗浄し、続いて1gのd-グルコース、0.84gのNaHCO3、および0.76gのBDMを添加した。 各心臓を切断して、ＬＶ内の乳頭筋を注意深く露出させた。 前述のように 34、乳頭筋を解剖スコープ (V8 Stereo、PlanAPO S 0.63× FWD 81 mm、Zeiss、カリフォルニア州ダブリン) で切除し、封入弛緩溶液で 10% にあらかじめ希釈した 1% Triton X-100 で一晩透過処理しました ( 97.92 mM KOH、6.24 mM ATP、10 mM EGTA、10 mM Na2CrP、47.58 mM プロピオン酸カリウム、100 mM BES、6.54 mM MgCl2、および 1 mM DTT) を 4 °C で使用して、細胞膜および膜結合タンパク質を除去します。 次いで、乳頭筋を、解剖顕微鏡下で長さ約１ｍｍの線維束にさらにトリミングした。 均一性に基づいてまっすぐな繊維束を選択し、アルミニウム製の T クリップで両端を取り付けました。 各繊維束を氷上で新鮮なリラックス溶液で穏やかに洗浄し、12 時間以内に使用しました。 次に、T クリップされたファイバーを力変換器と高速長さコントローラー (Aurora Scientific, Inc.、オーロラ、オンタリオ州、カナダ) に取り付けました。 筋肉の寸法（断面積、長さ）は、解剖顕微鏡に取り付けられた接眼マイクロメーターを使用して測定されました（解像度、〜10μM）。 これらの筋肉の寸法は、収縮力とサルコメアの長さを正規化するために使用されました。 後者は 2.0 μM に設定され、Aurora の高速ビデオ サルコメア長 (HVSL) 測定システムを通じて継続的にモニタリングされました。 筋線維の付着の強さと消耗は、実験プロトコルの開始時と終了時に付着した線維を最大カルシウム飽和度の活性化溶液に曝露することによって決定されました。 発現する等尺性力を、ペプチドの存在下または非存在下でさまざまなカルシウム濃度（pCa 10.0から4.5）で記録し、各活性化サイクルでのすべての力記録からゼロベースライン力レベルを差し引いた。 すべての力の測定値はランダウンについて補正され、断面積に対して正規化されました。 ランダウンが 20% を超える繊維はデータ分析から除外されました。 データは、Aurora の 600A リアルタイム筋肉データ取得および分析システムを使用して取得されました。 個々の力とカルシウムの関係は、修正されたヒル方程式 (Force/Forcemax = [Ca2+]n/(pCa50n + [Ca2+]n) (n はヒルの傾き)) に当てはめられました。同様に、張力の再発達速度 (ktr) は次のように計算されました。 AAA、DDD、および NTG 心臓組織から採取した線維でも pCa 4.5 で測定されました。

すべてのデータは、特に指定のない限り、平均値±平均値の標準誤差 (SEM) として表されます。 統計分析は、GraphPad Prism (v 6.0、GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実行されました。 データは、Tukey の事後検定を備えた二元配置分散分析を使用して分析されました。 p < 0.05 の値は統計的に有意であるとみなされました。

非リン酸化アラニン

拡張型心筋症

リン酸化模倣アスパラギン酸

蒸留水

拡張末期容積

駆出率

収縮終期容積

力

フルオレセインイソチオシアネート

全長

肥大型心筋症

ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子

ヒト人工多能性幹細胞

強制再開発率

左心室内径拡張末期

左心室内径収縮終期

ミオシン重鎖

心筋梗塞

ミオシン軽鎖

非トランスジェニック

α-トロポミオシン

トロポニンT

トロポニン I

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図 7 の図の作成にご協力いただいた、Merck Creative Studios の科学および医学教育担当リサーチ プレゼンテーション デザイナーの Ifet Armstrong に感謝します。

Mohit Kumar は、米国心臓協会博士前期フェローシップ (17PRE33630192) によって支援されました。 Sakthivel Sadayappan は、国立衛生研究所の助成金 R01 AR078001、R01 HL130356、R38 HL155775、および R01 HL143490 からの支援を受けています。 米国心臓協会 2019 年度学部学生賞 (19UFEL34380251) および変革賞 (19TPA34830084) を受賞。 ノボ ノルディスク、アムジェン、アストラゼネカ、ミオカルディア、メルクからのサポート。

これらの著者は同様に貢献しました: Luqia Hou と Mohit Kumar。

心臓代謝部門、Merck & Co., Inc.、213 East Grand Ave.、South San Francisco、CA、94080、米国

ルキア・ホウ、プリティ・アナンド、インホン・チェン、ネスリン・エル・ビズリ、ガヤスリ・スワミナト

分析研究開発、Merck & Co., Inc.、South San Francisco、CA、94080、米国

チャド・J・ピケンズ

Discovery Chemistry、Merck & Co., Inc.、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州、94080、米国

W・マイケル・セガニッシュ

シンシナティ大学心臓肺血管研究所内科心臓血管健康および疾患部門、シンシナティ、オハイオ州、45267、米国

モヒト・クマール & サクティベル・サダヤッパン

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LH と MK はこの作業に等しく貢献しました。 LH、MK、SS、GS が実験を考案し、設計しました。 LH、MK、PA、YC、NE、および CP が実験を実行し、実験データを分析しました。 WMS はペプチドの合成に役立ちました。 LH と MK が原稿を書きました。 GS と SS は原稿の執筆、編集、レビューを支援しました。 著者全員が原稿を読みます。

ガヤスリ・スワミナトへの通信。

Sakthivel Sadayappan は、Leducq Foundation、Pfizer、Novo Nordisk、Amgen、AstraZeneca、MyoKardia にコンサルティングと共同研究を提供しましたが、そのような仕事はこの原稿の内容とは無関係です。 著者は、この記事の内容と利益相反がないことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Hou、L.、Kumar、M.、Anand、P. 他。 心臓ミオシン結合プロテイン-Cペプチドによるミオシンの調節は、ex vivo実験的心不全モデルにおける心臓の収縮性を改善します。 Sci Rep 12、4337 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-08169-1

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受信日: 2021 年 10 月 5 日

受理日: 2022 年 3 月 3 日

公開日: 2022 年 3 月 14 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-08169-1

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